目 录
实验一：移液器使用……………………………………………………………………………… 4
实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化………………………………………………………….9
实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA………………………………………………………………11
实验四、五：目的片段的切胶回收与DNA重组……………………………………………….14
实验六、七：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化…………………………………………….17
实验八：（重组）质粒DNA的提取…………………………………………………………….21
实验九：PCR基因扩增技术筛选重组子………………………………………………………..24
实验十：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测………………………………………….26
《分子生物学》实验课程简介
适用专业 生物技术、生物科学、生态学
学 时 54
学 分
课程性质 必修
预修课程 生物化学、遗传学、 微生物学、细胞生物学
一． 本课程的性质、地位和作用
分子生物学实验是生物科学和生物技术专业的一门专业基础课程，是一门独立的实验课程，同时也是为了配合分子生物学的教学而开设的。实验过程中，首先将有关的基本原理、基本技术和方法给学生做一介绍，然后将分子生物学实验中要用到的仪器以课件的形式展示给学生，在学生掌握了以上基本知识的基础上给定实验内容和目的，让学生自行设计实验方案并完成，得出一定的实验结论。希望通过本实验培养学生主动学习、学以致用、独立思考的能力。
二. 实验内容选编原则与要求
分子生物学实验教学内容选编原则与要求是，根据生物科学和生物技术专业人才的培养目标所需要的基本理论和基本技能的要求，根据本课程的教学性质、条件和教学实践而制定的。既要涵盖分子生物学的基本实验技术，也要体现现代分子生物学发展的新方法、新技术。全书所选实验项目分为两个部分，第一部分为基础性实验, 包括感受态细胞的制备与转化、质粒DNA的提取及酶切、琼脂糖凝胶电泳检测DNA、DNA重组、基因组DNA的分离提取、DNA序列测定、PCR基因扩增、真核基因在原核细胞中的表达等内容。要求学生能够掌握基本的实验操作技能。
三. 教学安排与时数
本实验课程在三年级上学期开设，总计54学时。
四. 考核方法与要求
1．平时成绩：包括出勤、实验操作，实验效果、讨论情况等，占30%
2．报告成绩：实验报告等，占30%
3．考试成绩：占40%
4．综合考核成绩：平时成绩+设计成绩+报告成绩+考试成绩
实验守则及要求
1. 穿着要整洁，必须穿实验服。
2. 实验室内禁止吃食物，勿高声谈话及随便走动。
3. 实验前必须认真预习，熟悉实验的内容，了解所用的仪器用具：实验中应严格按操作规程进行，认真操作、仔细观察，及时记录实验现象及结果：实验结束后，籽细地分析和总结实验结果，认真做好每一次的实验报告。
4. 实验器具应保持清洁，任何使用过的器具及玻璃器皿必须洗净后放回原处。使用贵重精密仪器时，应严格遵守操作规程，发现故障立即报告，不得擅自拆检。
5. 实验台面应随时保持整洁、仪器、药品摆放整齐。公用试剂用完后，应立即盖好放回原处。
6. 值日生制度：每天安排3-4人值日，其职责是负责实验器具的整理、操作台、水槽、地板等实验室卫生工作和一切服务性工作，并注意实验室的水、电、门、窗等方面情况。
注意事项
l. 实验前应做好试剂的配置、用品灭菌等准备工作。配置基因工程各种试剂，必须要使用重蒸水。
2. 使用后的器皿必须认真清洗干净，洗完后还要用重蒸水冲洗三次。
3. 凡是可以进行灭菌的试剂与用具都必须要经过高压蒸汽灭菌后进行使用，防止其他杂质或酶对DNA、RNA或蛋白质的降解。
4. 凡是基因工程操作所用的一切塑料器具(Eppendorf管、吸嘴等)，在使用前都应装入盒子和瓶子中灭菌，且装盒或装瓶过程中都应采用镊子，或戴上一次性手套进行操作，不能直接用手去拿，严防手上杂酶污染。
5. 对于Eeppendorf管、吸嘴与非玻璃离心管等只能湿热灭菌，然后放置在50°箱中烘干后使用。
6. 实验中加入任何试剂后应注意样品的混匀，保温等反应后的样品也应离心摔一下后再进行下步的实验。
7. 限制性内切酶等工具酶保存于50%的甘油中，-20°可以长期保存。应自始至终将酶保持在零度以下，取酶时不能用手指接触储存酶的部分。在需要加酶的时候将酶从冰箱中
取出，放在冰盒里，用完后立即放回冰箱。
8. 微量移液器的使用：微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器。其装有直接读数容量计，读数由三位拨号数字组成，在移液器容量范围内能连续调节，从上(最大数)到下(最小数)读取。移液器的型号即是其最大容量值。按钮向下压以及放的动作、速度要缓慢平稳。注意事项见实验一。
9. 离心机的使用：应注意保持离心管放置位置的对称以及离心管中样品的平衡，并要拧紧盖好其中的离心机内部的盖子，否则会损坏仪器。此外应注意离心管在离心机内的放置方向。
10. 电子天平使用：
1) 注意在天平的最大称量范围内使用。
2) 天平应放在无振动、无空气对流处，使用前须先调节水平泡至中央位置。
3) 使用后应保持仪器的洁净。
11. 微波炉内不可使用金属容器以及空载。
12. 配制药品取试剂时，所用的钥匙不能混用，否则会造成药品污染。
13. 实验过程中应做好每个样品的标记工作，如样品的名称、保存的时间．且一般在
Eeppendorf管上用记号笔作标记时，应在两处重复做好标记。
实验一：移液器使用
一、实验目的
在进行分析测试方面的研究时，一般采用移液器（micropipette）量取少量或微量的液体。本次课程学习移液器的正确使用方法及其一些细节操作，以便于后期实验严谨的定量操作。
二、实验原理
微量的单位定义为微升（microliter，µL）
1升（liter，L） = 1,000 毫升(milliliters，mL)，
1毫升（mL） = 1,000 微升（µL）
三、实验材料、仪器和试剂
移液器、枪头及离心管
四、实验方法及步骤
（一）移液器量程认读
1. 量程：不同型号的微量移液器，各有其吸取体积范围，依取用溶液体积选用适当的微量移液器。
移液器规格 |
量程 |
P2 |
0.5 ~ 2µL |
P10 |
0.5 ~ 10µL |
P20 |
2 ~ 20µL |
P100 |
11 ~ 100µL |
P200 |
21 ~ 200µL |
P1000 |
201 ~ 1,000µL |
2. 数值窗口的认读
p1000 移液器 量程 201 ~ 1,000µL
0 |
5 |
0 |
500µL 窗口读数
p200移液器 量程21 ~ 200µL
1 |
5 |
0 |
150µL 窗口读数
p20 移液器 量程2 ~ 20µL
1 |
2 |
0 |
12µL 窗口读数
p2 移液器 量程0.5 ~ 2µL
1 |
0 |
0 |
1µL 窗口读数
（二）移液器的使用
1. 设定移液体积，
根据吸取液体的体积，选择适当的移液器。
在调节量程时，如果要从大体积调为小体积，则按照正常的调节方法，逆时针旋转旋钮即可；但如果要从小体积调为大体积时，则可先顺时针旋转刻度旋钮至超过量程的刻度，再回调至设定体积，这样可以保证量取的最高精确度。
2. 枪头的装配
将移液器垂直插入微量移液器枪头 (tip)中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合，上紧即可。
P1000 使用蓝色微量移液器头，P200 及P20 使用黄色微量移液器头，P2 使用白色微量移液器头。
严禁移液器撞击枪头，因为这样会导致移液枪的内部配件（如弹簧）因敲击产生的瞬时撞击力而变得松散，甚至会导致刻度调节旋钮卡住，长期这样操作会导致移液器的零件损坏。
3. 移液的方法
吸取液体时，移液器保持竖直状态（角度控制在倾斜20度之内），将枪头插入液面下。在吸液之前，可以先吸放几次液体以润湿吸液嘴（尤其是要吸取粘稠或密度与水不同的液体时）。
这时可以采取两种移液方法。
一是前进移液法。用大拇指将按钮按下至第一停点，然后慢慢松开按钮回原点。接着将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻继续按按钮至第二停点吹出残余的液体。最后松开按钮。
二是反向移液法。此法一般用于转移高粘液体、生物活性液体、易起泡液体或极微量的液体，其原理就是先吸入多于设置量程的液体，转移液体的时候不用吹出残余的液体。先按下按钮至第二停点，慢慢松开按钮至原点。接着将按钮按至第一停点排出设置好量程的液体，继续保持按住按钮位于第一停点（千万别再往下按），取下有残留液体的枪头，弃之。
吸液速度：移液操作应保持平顺、合适的吸液速度；过快的吸液速度容易造成样品进入套柄，带来活塞和密封圈的损伤以及样品的交叉污染。
4. 枪头浸入深度建议如下所示：
移液器规格 |
吸头浸入深度 |
2µL和10 µL |
1 mm |
20µL和100 µL |
2-3 mm |
200µL和1000 µL |
3-6 mm |
5. 移液器的正确放置
使用完毕，可以将其竖直挂在移液枪架上，但要小心别掉下来。
五、注意事项
1. 如不使用，要把移液器的量程调至最大值的刻度，使弹簧处于松弛状态以保护弹簧。
2. 套有微量移液器头的微量移液器，无论微量移液器头中是否有溶液，均不可平放，需直立架好。
3. 吸取酸液或具腐蚀性溶液后，请将微量移液器拆解开，各部位零件以蒸馏水冲洗干净，擦干后再正确组合回复原状。
4. 若不小心使溶液进入吸管柱内时，应予以拆解，将活塞组件、吸管柱等各部位以清水冲洗干净后，再以酒精擦拭，擦干后再正确组合回复原状。
5. 定期自行以天平检查准确度，若有任何问题请送厂维修。
六、思考题
1、如果移液器移液体积不准确，可能是什么原因，该如何维护？
实验二：质粒DNA的限制性内切酶消化
一、实验目的
通过本实验学习和掌握DNA 的限制性内切酶酶切原理及技术。
二、实验原理
Ⅱ类限制性内切核酸酶在分子克隆中得到了广泛应用，它们是重组DNA 的基础。Ⅱ类限制酶识别长度为4 至6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列(如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列:5'- G↓AATTC-3')，有少数酶识别更长的序列或简并序列，并在这个顺序内进行切割，产生特异的DNA片段；切割双链DNA产生3种不同的切口－－平末端(如SmaⅠ:5'-CCC↓GGG-3')，有的切割位点在对称轴一侧，产生带有单链突出末端的DNA 片段称粘性未端,包括5’端突出；3’端突出。
如EcoRⅠ切割识别序列后产生两个互补的粘性末端。
三、实验材料、仪器和试剂
（一）仪器
恒温培养箱/恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅、移液器。
（二） 材料
含有GFP的克隆载体（质粒）pUC1l9-GFP、原核表达载体pET-22b（质粒图谱见图2.1）；无菌吸头和微量离心管。
图2.1 pUC1l9-GFP与pET-22b质粒的图谱
（三） 试剂
限制性内切酶EcoRI（10 units/µL）、Hind III（10 units/µL）、10x酶切反应缓冲液。
四、实验方法及步骤
取质粒DNA 1µg，加3µL 10x酶切缓冲液，EcoRI和Hind III酶各1 µL, 无菌水补至总体积30µL，轻缓吹吸混匀，37℃培养箱或恒温水浴保温3 h。
五、注意事项
[注意]
1. 酶解反应完成后，如不能及时进行下一步操作，酶解液需冷冻保存（-200C）。
2. 当微量的污染物进入限制性内切酶贮存液中时，会影响其进一步使用，因此在吸取限制性内切酶时，每次都要使用新的吸管头。
3. 如果采用两种限制性内切酶，必须要注意分别提供各自的最适盐浓度。若两者可用同一缓冲液，则可同时水解。若需要不同的盐浓度，则低盐浓度的限制性内切酶必须首先使用，随后调节盐浓度，再用高盐浓度的限制性内切酶水解。也可在第一个酶切反应完成后，用等体积酚/氯仿抽提，加0.1 倍体积3mol/L NaAc 和2 倍体积无水乙醇，混匀后置-70℃低温冰箱30 分钟，离心、干燥并重新溶于缓冲液后进行第二个酶切反应。
4. 内切酶的酶解反应最适条件各不相同，各种酶有其相应的酶切缓冲液和最适反应温度(大多数为37℃)。对质粒DNA 酶切反应而言，限制性内切酶用量可按标准体系1μg DNA 加1 单位酶，消化1-2 小时。但要完全酶解则必须增加酶的用量，反应时间也要适当延长。
六、思考题
1、通过PCR手段获得目的基因，如何在目的基因上添加酶切位点？
实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA
一、实验目的
通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。
二、实验原理
DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。
DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。如质粒，有3种构型：超螺旋的共价闭合环状质粒DNA(covalently closed circular DNA，简称CCCDNA)，开环质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 1条链断裂，(open circular DNA，简称OCDNA)，线状质粒DNA，即共价闭合环状质粒DNA 2条链发生断裂(1inear DNA，简称L DNA)。这3种构型的质粒DNA分子在凝胶电泳中的迁移率不同。因此电泳后呈3条带，超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。
琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA 片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA 片段。用各种浓度的琼脂糖凝胶可分离长度200bp~50kb的DNA。.当用低浓度的荧光嵌入染料染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng 的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA 条带，用于以后的克隆操作。
对于天然的双链DNA，常用的几种电泳缓冲液有TAE[含EDTA (pH8.0)和Tris-乙酸]，TBE(Tris-硼酸和EDTA)，TPE(Tris-磷酸和EDTA)，一般配制成浓缩母液，储于室温。
三、实验材料、仪器和试剂
（一）仪器
恒温培养箱、琼脂糖凝胶电泳系统 、台式离心机、高压灭菌锅、紫外线透射仪。
（二） 材料
三羟甲基氨基甲烷(Tris) 、冰乙酸、乙二胺四乙酸(EDTA)、溴酚蓝、蔗糖、琼脂糖、无毒荧光染料、DNA marker、pET-22b、pUC119-GFP，pET-22b与pUC119-GFP的酶切产物（来自实验二）
（三） 试剂
1．50×TAE电泳缓冲液（储存母液，使用前稀释50倍）
1000 mL 50× TAE： Tris 242g， 57.1mL冰乙酸， 0.5 mol/L EDTA 100 mL， pH 8.0
2．凝胶加样缓冲液(6×) ： 溴酚蓝 O.25%， 蔗糖 40%
3．琼脂糖
4．无毒荧光染料
四、实验方法及步骤
（一）制备琼脂糖凝胶
按照被分离DNA的大小，决定凝胶中琼脂糖的百分含量。实验采用1%琼脂糖凝胶。
称取0.5 g琼脂糖，放人锥形瓶中，加入50 mL 1 ×TAE缓冲液，置微波炉或水浴加热至完全溶化，取出摇匀，即为1% 琼脂糖凝胶液。
（二）胶板的制备
1．将有机玻璃内槽放置于水平位置，并放好样品梳子。
2．将冷到70℃左右的琼脂糖凝胶液，加入无毒荧光染料，摇匀，缓缓倒入胶模中凝固30min以上(注意不要形成气泡)。
3．待胶凝固后，平衡拔出梳子，放在电泳槽内。加入电泳缓冲液至电泳槽中（淹过胶面），备用。
（三） 加样
用移液枪将DNA marker和已加入上样缓冲液的DNA样品（pET-22b、pUC119-GFP及两者的酶切产物）加入点样孔(记录点样顺序及点样量)。
（四）电泳
1. 接通电泳槽与电泳仪的电源(注意正负极，DNA片段从负极向正极移动)。DNA的迁移速度与电压成正比，最高电压不超过5 V/cm。
2. 当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2 cm处，停止电泳。
3．用紫外凝胶观测仪观察和记录实验结果。
五、注意事项
在紫外灯下观察时应戴上防护眼镜，紫外线对眼睛有伤害作用
六、思考题
1、如果电泳结果中，双酶切质粒条带有多条，可能的原因是什么？
实验四、五：目的片段的切胶回收与DNA重组
一、实验目的
通过本实验学习利用凝胶回收试剂盒切胶回收目的片段及体外重组DNA（载体片段与目的片段的连接）的基本方法。
二、实验原理
通过琼脂糖凝胶电泳分离出的DNA片段可以通过将凝胶重新融解，用酚氯仿抽提的方法从凝胶中回收目的片段。过去需要使用熔点42℃左右的低熔点琼脂糖制备凝胶以减少回收过程中DNA片段的损伤及损失。现在，从琼脂糖凝胶中回收目的片度基本采用商品化的凝胶回收试剂盒，DNA回收效率较高。
如果从凝胶中回收的条带是外源DNA片段和选定的表达载体片段，在连接酶的作用下使外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。
重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。通使用T4噬菌体DNA连接酶。T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′-磷酸基和3′-羟基切口的DNA上．使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。 连接反应的温度在37°时有利于连接酶的活性。但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。因此人们找到了一个折中温度，即12-16°C，连接12-16 h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
三、实验材料、仪器和试剂
（一） 仪器
恒温水浴器、微量离心机、电泳槽、电泳仪。
（二） 材料
pET-22b与pUC119-GFP的DNA酶切产物、琼脂糖、T4 DNA连接酶等。
（三） 试剂
1．TE缓冲液： 10 mmol/L Tris.HCl(pH 8.0)，l mmol/L EDTA(pH 8.0)
2．凝胶回收试剂：见爱思进（Axygen）凝胶回收试剂盒
四、实验方法及步骤
（一）重组DNA片段的制备
按实验二的酶切方法用EcoRI和HindIII双酶切表达载体pET-22b及包含外源片段GFP编码基因的克隆载体质粒pUC119-GFP。
（二） 琼脂糖凝胶电泳分离重组DNA片段
按实验三方法进行电泳（1%琼脂糖凝胶）。
（三） 凝胶回收试剂盒回收电泳分离的DNA 片段
1．切胶：电泳结束后，在UV光下切下目的条带，置于已经称重的1.5mL微量离心管中，称量凝胶重量。
2．融胶：加入3倍凝胶重量的Buffer A（粉红色）至装有凝胶块的微量离心管中，75℃融胶6-8分钟，至胶块完全融化。
3．在融胶液中加入二分之一体积于Buffer A的Buffer B，吹吸混匀（溶液将变为亮黄色），移取液体至置于收集管上的层析柱，12,000rpm 、离心30-60秒。
4．弃去收集管中的废液，将层析柱放回收集管中，吸取500µLBuffer W1到层析柱中，12,000rpm室温离心30-60秒。
5．弃去收集管中的废液，将层析柱放回收集管中，吸取700µLBuffer W2到层析柱中，12,000rpm室温离心30-60秒。重复步骤5。
6．弃去收集管中的废液，将层析柱放回收集管中，12,000rpm室温离心60秒以尽量除去残余Buffer W2。
7．将层析柱放入新的洁净1.5-mL离心管中，做好标记，加50µL Elution Buffer至柱子中央，室温放置1分钟以上，12,000rpm室温离心2分钟。离心管中的溶液即为回收的目的片段DNA。
（四）琼脂糖凝胶电泳检验回收片段效果（选做）
吸取纯化产物（载体片段DNA 2µL， GFP编码基因片段DNA 6µL）按实验三方法进行电泳（1%琼脂糖凝胶）。
（五） 目的片段DNA的重组 （既：连接反应）
1．连接/重组：在EP管中，加入50 ng载体片段，然后按照摩尔比 1：3（载体片段：外源片段）计算并添加外源目的片段DNA，再添加1µL 10×T4 DNA 连接酶Buffer，1µLT4 DNA 连接酶，最后加ddH2O补齐至10µL，吹吸混匀后于16℃水浴作用16h或者4℃连接过夜。
2．转化：参见实验八。
备注：每组两个人，一人回收外源片段，一人回收载体片段，操作过程注意做好标记。
五、注意事项
1、溶胶过程中，保证胶完全融化；
2、避免紫外直射眼睛
六、思考题
1、已获知载体与目的片段的质量浓度，如何计算摩尔比？
实验六、七：大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验目的
通过本实验，掌握氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞的方法及外源质粒 DNA 转入受体细胞并筛选转化体的方法。
二、实验原理
转化（ transformation ）是指一段同源或异源的 DNA 转入受体细胞并得到表达的基因转移过程，是现代分子生物学研究和基因工程不可缺少的重要技术。
转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体（Rˉ，Mˉ），它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。受体细胞经过一些特殊方法（如电击法，CaClB2 ，RbCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞（Competent cells）。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，使进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状（如抗生素抗性）。而后经过转化的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
目前常用的感受态细胞制备方法有CaClB2B和RbCl 法，RbCl 法制备的感受态细胞转化效率较高，但CaClB2B 法简便易行，且其转化效率完全可以满足一般实验的要求，制备出的感受态细胞暂时不用时，可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存（半年），因此CaClB2B 法为使用更广泛。至于CaClB2B使细菌细胞获得接受外源DNA能力的机制目前尚不清楚。
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选，鉴别重组子和非重组子。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。现在使用的许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码。肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′ 基因。lacZ′ 基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。lacZ'基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)显色测定出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPTG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的阅读框，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重组质粒载体的克隆往往是白色菌落。
三、实验材料、仪器和试剂
（一） 仪器
超净工作台、低温离心机、恒温摇床、恒温箱、-70℃冰箱、制冰机、恒温水浴器。
（二） 材料
氯化钙(CaCl2)、LB培养基（胰蛋白胨1%，酵母提取物0.5%，氯化钠1%；固体培养基添加1.5%琼脂）、氨苄青霉素、大肠杆菌BL21(DE3)、实验五六制备的重组DNA连接产物、1.5mL微量离心管、、吸嘴、微量离心管、培养皿、锥形瓶等。
（三） 试剂
1．0.1 mol/L CaCl2溶液
2．LB液体培养基 （pH7.0；121℃湿热灭菌20 min）
3. LB固体培养基：每升LB培养基中加15 g琼脂。
4.氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100 mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
四、实验方法及步骤
（一）感受态细胞制备-----冰冷是关键
1. 从大肠杆菌BL21(DE3)平板上挑取一个单菌落接于2 mL LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
2. 取0.5 mL菌液转接到一个含有50 mL LB液体培养基锥形瓶中，37℃振荡培养2-3h。(此时，OD600≤0.6-1.0，细胞数务必 <108／mL，此为实验成功的关键)。
3．将菌液转移到1.5 mL离心管中，冰上放置10 min。
4．4℃ 8000 r/min，离心1 min。
5. 倒出培养液（可用移液器尽量吸去）。
6. 用1.0 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮沉淀，4℃ 离心1 min (6000 r/min)，回收细胞。
7. 用1.0 mL冰冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮沉淀，立即放在冰上作用15 min以上。
8．4℃ 6000 r/min，离心1 min。
9．吸去850-900μL CaCl2溶液，用剩下的100-150 μL冰冷的0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞(务必冰上操作)。此细胞即为感受态细胞。
备注：如果大批量制备，则最后重悬CaCl2处理后的细胞时，改用冰冷的、含有8-12%甘油的0.1 mol/L CaCl2悬浮细胞，分装成合适量，保存于-80℃可达半年以上。
（二）外源质粒（连接产物）转化
10. 取100 μL新鲜制备的感受态细胞，加入实验四五制备的重组DNA连接产物 10μL，冰上吹吸混匀，冰上放置30 min。
同时做两个对照管。
- 对照1：受体菌对照（不加任何外源DNA），100μL感受态细胞+10μL无菌水
- 对照2：质粒对照，100μL 0.1 mol/L CaCl2溶液+2μL质粒DNA溶液
11．将管放到42°热激90-120s。
12．冰浴2 min。
13. 每管加800μL LB液体培养基，37°培养l h (慢摇)。
14. 离心收集细胞，保留100μL左右培养基，弃去多余上清液，吹吸重悬细胞，涂在含有氨苄青霉素(100μg/mL)的培养皿中。
15．倒置平皿37°培养12-16h，观察菌落，统计每个培养皿中的菌落数。
在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子（转化子不同于重组子，转化子有可能是载体片段自连造成），根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和。
（三）计算转化效率
对照2组转化使用的是原始质粒，其转化结果可以用于计算感受态细胞的转化效率。
转化效率: 每微克(μg) 质粒DNA转化后可以形成的菌落（转化子）数。公式如下：
转化效率= 转化子总数／质粒DNA（对照组2）加入量(μg)
转化子总数＝菌落数（对照组2）× 稀释倍数 × 转化反应原液总体积／涂板菌液体积
五、注意事项
1、制备感受态的细菌应处于对数生长期；
2、感受态制备过程中，要保持低温；
3、严格控制转化过程各步骤的温度及时间；
4、本实验方法也适用于其它E.coli 受体菌株的不同的质粒DNA 的转化。但它们的转化效率并不一定一样。有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心),才能较准确的计算转化率。
六、思考题
1、除了化学方法CaCl2，还有哪些其他方法可以进行转化操作？
实验八：（重组）质粒DNA的提取
一、实验目的
通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理及试剂盒法提取质粒的技术
二、实验原理
碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线性的DNA双螺旋结构解开而被变性，尽管在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂，但两条互补链彼此相互盘绕，仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复pH至中性时，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA，蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
实验采用国产的质粒小量抽提试剂盒。在前期碱裂解是基础上，将裂解液加到一种新型的离子交换柱，在特定的条件下，使质粒能在离心过柱的瞬间，结合到质粒纯化柱上，在一定条件下又能将质粒充分洗脱，从而实现质粒的快速纯化。而且在提取过程中，无需酚-氯仿抽提、无需酒精沉淀，可在较短时间内完成质粒的提取和纯化。
三、实验材料、仪器和试剂
（一） 仪器
恒温培养箱、恒温摇床、恒温水浴、台式离心机、高压灭菌锅，电泳槽及电泳仪。
（二） 材料
葡萄糖、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氢氧化钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、乙酸钾、冰乙酸、氯仿、乙醇、胰RNA酶、氨苄青霉素 （Amp）、实验七中所得的阳性单克隆（可能含有重组质粒pET22b-GFP）的过夜培养物，实验三中的材料。
（三）试剂
1．溶液I：50 mmol/L 葡萄糖；25 mmol/L 三羟甲基氨基甲烷(Tris)Tris.HCl(pH 8.0)；10 mmol/L 乙二胺四乙酸(EDTA)(pH 8.0)。
2．溶液II：0.4 mol/L NaOH，2% SDS，用前等体积混合。
3．溶液III：5 mol/L 乙酸钾 60 mL；冰乙酸 11.5 mL； 水 28.5 mL。
4．TE缓冲液：10 mmol/L Tris.HCl(pH 8.0)；1 mmol/L EDTA(pH 8.0)。
5．70% 乙醇(放-20°冰箱中，用后即放回)。
6．RNA酶：将RNA酶溶于10 mmol/L Tris.HCl(pH 7.5)、15 mmol/L NaCl中，配成10 mg/mL的浓度，于100°加热15 min（灭活DNase），缓慢冷却至室温，保存于-20°C。
7.实验三中的试剂
四、实验方法及步骤
（一） 提取质粒 （方法一和二中任选一种）
方法一、常规碱裂解法
1．从平板上挑取单菌落，接种于5 mL含抗生素Amp的培养基中。置于37℃下200 rpm振荡过夜培养。将培养物装在1.5 mL微量离心管中，12000 rpm离心30秒，去上清。
2．加入100 µL溶液Ⅰ，涡旋重悬细胞。
3．加入200 µL新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口，轻缓颠倒离心管5次以上以混合内容物，应确保离心管的整个表面均与溶液Ⅱ接触，不要振荡，将离心管置于冰上。
4．加入150 µL预冷的溶液Ⅲ。盖紧管口，将管温和颠倒数次，使溶液Ⅲ将粘稠的细菌裂解物中充分分散均匀，之后将管置于冰上3-5分钟。
5． 12000 rpm离心5分钟，将上清转移到另一洁净微量离心管中。
6．加等量酚:氯仿（25:24），振荡混匀，4℃ 、12000 rpm离心2分钟，将上清转移到另一微量离心管中。
7．用2倍体积的乙醇于-20℃沉淀双链DNA，振荡混和，于-20℃放置15分钟以上。
8．4℃ 、12000 rpm离心5分钟。
9．小心吸去上清液，将离心管倒置于吸水纸上，使所有液体流出，再将附于管壁的液滴除尽。
10．用1 mL 70%乙醇于室温洗涤双链DNA沉淀，按步骤“8”所述方法去掉上清，在空气中使核酸沉淀干燥至沉淀呈透明状。
11．用50 µL含RNaseA（20 µg/mL）的TE重新溶解核酸，贮存于-20℃。
方法二、柱式质粒小量抽提(Tian gen质粒小提试剂盒)
1．将过夜培养的1～4mL细菌12,000rpm离心30秒，彻底去除上清。
2．加入250 µL S1（含RNase），用枪头或振荡器充分悬浮细菌。
3．加入250 µL S2，立即温和混匀（倾斜45度角，顺一个方向，慢慢旋转离心管），使细菌裂解，室温放置不要超过5分钟。
4．加入350 µL S3，立即上下颠倒5～10次，使之充分中和，管中出现白色絮状沉淀，12,000rpm，离心10分钟。
5．将步骤4中上清转移到套放于2.0 mL收集管内的层析柱中（注意尽量不要吸上沉淀），12,000rpm 、离心30-60秒。
6．弃去收集管中的废液，将层析柱放入同一支收集管中，吸取500 µL去蛋白液 W1 到层析柱中，12,000 rpm室温离心30-60秒。
7．弃去收集管中的废液，将层析柱放入同一支收集管中，吸取700 µL漂洗液 W2 到层析柱中，12,000rpm室温离心30-60秒。 重复步骤 7 一次。
8．弃去收集管中的废液，将层析柱放入同一支收集管中，12,000 rpm室温离心1分钟以彻底去除漂洗液 W2。
9．将层析柱放入新的洁净1.5-mL离心管中，加50µL Elution Buffer，室温放置2分钟，12,000rpm室温离心2分钟。离心管中的溶液即为抽提的质粒DNA。
（二）琼脂糖凝胶电泳检验分析所得质粒的大小及浓度（选做）
吸取5µL提取产物按实验三方法进行电泳（1%琼脂糖凝胶）。
五、注意事项
1、提取质粒过程中，加入溶液II及III后，混匀动作要轻柔；
2、提取质粒时，洗脱液应该加入在层析柱中间位置。
六、思考题
1、如纯化后的质粒，进行核酸电泳时，在点样孔附近有较亮的染色，可能是什么原因？
实验九：PCR基因扩增技术筛选重组子
一、实验目的
通过本实验学习PCR反应的基本原理与实验技术。
二、实验原理
多聚酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程。在待扩增的DNA片段两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。
1．变性：模板DNA在高温下(94℃)变性，双链间氢键断裂而形成两条单链，即变性。
2．退火：使溶液温度降至50-60℃，模板DNA与引物按碱基配对原则互补结合，即退火。
3．延伸：溶液反应温度升至72℃，耐热DNA聚合酶以单链DNA为模板，在引物的引导下，利用反应混合物中的4种脱氧核苷三磷酸(dNTP)，按5′-3′方向复制出互补DNA，即引物的延伸。
上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过25-30个循环后DNA可扩增106-109倍。
典型的PCR反应体系由如下组分组成：DNA模板、反应缓冲液、dNTP、MgCl2、两个合成的DNA引物、耐热Taq聚合酶。
三、实验材料、仪器和试剂
（一） 仪器
PCR热循环仪、琼脂糖凝胶电泳系统。
（二） 材料
DNA模板（实验八中从阳性克隆中提取的质粒DNA）、4种dNTP、引物l、引物2、Taq酶、琼脂糖 （电泳级）、DNA相对分子质量标准物、吸头、PCR管。
（三） 试剂
1．10×PCR缓冲液
2．4x dNTP（各2.5mmol/L）
3．Taq酶 1 U/μL
4．DNA模板 1 ng/μL
5．引物1、引物2（引物浓度 10 pmol/μL）
四、实验方法及步骤
1．在0.5 mL Eppendorf管内配制25 μL反应体系：
反应物 体积／μL
ddH20 17
10xPCR缓冲液 2.5
2.5 mmol/L dNTP 2.0
引物1 1.0
引物2 1.0
模板DNA 0.5
Taq酶（1U/μL） 1.0
2．按下述程序进行扩增
① 94℃预变性5 min；
② 94℃变性 30s
③ 52℃退火 30s
④ 72℃延伸 30s
⑤ 重复步骤②-④25次
⑥ 72℃延伸10 min。
3．琼脂糖凝胶电泳分析PCR结果
配制1% 琼脂糖凝胶，取10 μL扩增产物电泳。电泳结束后，紫外灯下观察结果。
备注：本实验扩增片段长770 bp。
五、注意事项
1、在添加PCR体系时，由于移液体积较小，要注意移液后，枪头中是否有残留
六、思考题
1、除了PCR的方法进行阳性克隆的鉴定，还有何种方法可以筛选阳性克隆
实验十：外源基因在大肠杆菌中的诱导表达和检测
第一部分 外源基因在大肠杆菌中的诱导表达
一、实验目的
通过本实验了解外源基因在原核细胞中表达的特点和方法。
二、实验原理
将外源基因克隆在含有lac启动子的表达载体中，让其在E．coli BL21(DE3)中表达。先让宿主菌生长，lacI 产生的阻遏蛋白与 lac操纵序列结合，从而不能进行外源基因的转录及表达，此时宿主菌正常生长。 然后向培养基中加入lac操纵子的诱导物IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖)，阻遏蛋白不能与操纵基因结合，则DNA外源基因大量转录并高效表达。表达蛋白可经SDS-PAGE检测(本实验II)或做Western-blotting（蛋白免疫印迹），用抗体识别之。
三、实验材料、仪器和试剂
（一） 仪器
恒温摇床、培养用锥形瓶、超静工作台、低温离心机、干热灭菌箱。
（二） 材料
克隆在E．coli表达载体中的外源基因、氨苄青霉素(ampicillin，Amp)、异丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)、滤菌膜，滤器、移液管、吸头等。
（三） 试剂
1．LB培养基
2．50 mg/mL Amp过滤菌膜于灭菌小指管中，-20℃贮存。
3. 100 mg/mL IPTG过滤菌膜于灭菌微量离心管中，-20℃贮存备用。
四、实验方法及步骤
1. 含外源基因的表达菌株在LB(含50 μg/mL Amp)培养基中预培养过夜(注意取菌株要在超静工作台上操作，一定注意无菌)。
2. 100 mL LB培养基加入100μL 50mg/mL Amp，使终浓度达50μg/mL按1/50-1/100比例加入过夜培养的上述LB培养液。于37℃恒温摇床，200r/min，培养3 h左右，使其OD600值达0.7-0.8(注意OD600的值要视不同茵株中不同外源蛋白的表达情况而定)。
3. 加入100μL mg/mL IPTG，进行外源基因的诱导表达。于37℃恒温摇床，220r/min，继续培养4-5 h(继续培养时间也需视蛋白表达情况而定)。
4. 4℃低温离心，4 000 r/min，20 min，收获菌体，弃上清。菌体放-20℃存放备用。
第二部分 SDS−PAGE检测表达蛋白
一、实验目的
学习SDS-PAGE的基本操作，学会用SDS-PAGE检测蛋白。
二、实验原理
蛋白质与SDS结合后，均带有负电荷，在电场下，按相对分子质量大小在板状胶上排列。
三、实验材料、仪器和试剂
（一）仪器
垂直电泳槽及配套的玻璃板、制胶架、梳子、普通恒压恒流电泳仪、沸水浴。
（二）材料
十二烷基硫酸钠(SDS)、丙烯酰胺(Acr)、N，N’- 亚甲基双丙烯酰胺(Bis)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸(Gly)、盐酸(HCl)、过硫酸胺(Aps)、四甲基乙二胺(TEMED)、低相对分子质量标准蛋白、预染标准蛋白(购自Bio-lab公司)、溴酚蓝、甘油、冰醋酸、乙醇、巯基乙醇、考马斯亮蓝R250 。
（三）试剂
1．1.5 mol/L Tris.HCl pH 8.8 (4°存放)。
2．0.5 mol/L Tris.HCl pH 6.8 (4°存放)。
3．10% SDS(室温存放)
4．30% Acr/Bis（37.5:1）：29.2 g Acr + 0.8g Bis，双蒸水定容至100 mL，过滤，4℃存放。
5．10% Aps（过硫酸铵）(-20℃存放)
6．2×上样缓冲液(室温存放) （2 mL 0.5 mol/L Tris.HCl pH 6.8、甘油 2 mL、20% (W／V)SDS 2 mL、0.1% 溴酚蓝 0.5 mL、β-巯基乙醇 1.0 mL 、双蒸水 2.5 mL、室温存放备用）
7．5× 电泳缓冲液(Tris 7.5 g, Gly 36 g, SDS 2.5 g, 双蒸水溶解，定容至500 mL，室温存放。使用时稀释5倍)
8．染色液：0.2g考马斯亮蓝R250 + 84 mL 95% 乙醇 + 20 mL冰醋酸，定容至200 mL，过滤。
9．脱色液: 医用酒精:冰醋酸:水=4.5:O.5:5(V:V:V)
10．保存液：7% 冰醋酸
四、实验方法及步骤
1．配制分离胶
① 架好胶板，安装制胶架。
② 配制分离胶： 5mL
凝胶浓度 |
8% |
10% |
12% |
15% |
单位 |
双蒸水 |
2.3 |
1.9 |
1.6 |
1.1 |
mL |
1.5 mol/LTris.HCI(pH 8.8) |
1.3 |
1.3 |
1.3 |
1.3 |
mL |
10% SDS |
50 |
50 |
50 |
50 |
μL |
30% Acr/Bis(37.5:1) |
1.3 |
1.7 |
2 |
2.5 |
mL |
TEMED |
3 |
2 |
2 |
2 |
μL |
10% Aps |
50 |
50 |
50 |
50 |
μL |
总体积/mL |
5 |
5 |
5 |
5 |
mL |
混匀后加人两玻璃夹缝中，并小心在胶面上加入1cm蒸馏水，约40 min，等胶自然凝聚后倾斜倒出蒸馏水 (在胶面上加入蒸馏水称水封，其目的是保持胶面平整和防止空气进入，影响凝胶)。
2．5% 浓缩胶的配制
双蒸水 1.4 mL
1.0 mol/L Tris.HCl pH 6.8 0.25 mL
10% (W／V)SDS 20 μL
Acr/Bis(30%) 0.33 mL
TEMED 2 μL
10% Ap 20 μL
总体积 2 mL
混匀后加入到夹缝中，插上梳子，待凝聚后小心拨出梳子，用100μL微量注射器抽取电极缓冲液冲洗梳子拔出后的加样凹槽底部，清除未凝的丙烯酰胺。
3．样品制备
菌体样品与2×上样缓冲液l:1混匀，并在100 °沸水浴中保温3-5 min，取出待用。
4．电泳
一孔加10 μL标准蛋白，一孔加样品(若做印迹，需加预染蛋白)。将玻璃板凝胶放人电泳槽中，并在槽中加入电极液，接通电源，电流调至lmA/孔，当样品进入分离胶时，调节电压使恒定在120 V。当溴酚蓝移动到离底部约0.5 cm时，切断电源，停止电泳。将胶板从电泳槽中取出，小心从玻璃板上取下胶。移去浓缩胶，将分离胶用考马斯亮蓝染色液染色，也可将此分离胶作印迹用。
5．染色
凝胶用染色液染色， 微波炉加热2min。将凝胶捞出，放置于沸水中脱色至胶的底色趋于透明无色，蛋白条带清晰。
五、注意事项
1、配置SDS-PAGE的试剂有毒性，要注意防护
六、思考题
1、通过SDS-PAGE及PCR的方式检测外源基因的表达，有何不同？
附件：分子生物学实验.docx
