近日，西北大学生命科学学院赵雪/李倩在国际分析化学权威杂志Biosensors and Bioelectronics（中科院1区Top）在线发表了题为“In situ cleavage-based sortase A-mediated site-specific immobilization of beta2-adrenoceptor on gold surface for surface plasmon resonance measurement”的研究论文，建立了基于细胞内双重酶促反应的固定化蛋白质芯片一步制备方法，并将其应用于药物-蛋白相互作用研究。

表面等离子体共振（SPR）技术是研究生物分子相互作用的关键手段，但其应用依然受限于蛋白质等生物分子的固定方法——传统随意固定化（如EDC/NHS策略）易导致蛋白取向混乱，而现有位点特异性固定技术又面临纯化步骤繁琐和空间位阻等问题。

本研究提出了一种基于细胞内双重酶促反应的SPR芯片蛋白质固定新策略，无需蛋白纯化即可实现蛋白质位点特异性一步共价固定。研究以β₂AR受体作为模型蛋白，构建了SrtA-KSLVPYGS-β₂AR-LPETG质粒。在大肠杆菌表达系统中，通过其内源酶酶促切割反应在同一体系中成功制备了SrtA酶和β2AR -LPETG蛋白，表明大肠杆菌表达蛋白过程中可成功实现细胞内原位酶促切割反应。以五聚甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素（GGGGG-AMC）为荧光探针，采用荧光标记法验证了同一细胞体系内SrtA酶介导的促连接反应；以溶液中生成的LPETGGGGG产物及其含量变化为指标，色谱法明确了SrtA酶催化的酶促连接反应效率（图1）。

图1  细胞内双重酶促反应策略设计与验证

（a）SrtA- KSLVPRGS -β2AR-LPETG和（b）SrtA- GGSGGSGS -β2AR-LPETG重组蛋白表达分析；（c）五聚甘氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素（GGGGG-AMC）结构式；（d）大肠杆菌细胞裂解液中GGGGG-AMC与LPETG连接的荧光胶分析; （e）大肠杆菌细胞裂解液中SrtA酶活性验证;（f）溶液中商品化SrtA催化LPETG与GGGGG连接反应色谱分析；（g）含SrtA的细胞裂解液催化LPETG与GGGGG连接反应色谱分析;（h）不同孵育时间下细胞裂解液催化LPETG与GGGGG连接反应色谱分析。

进一步，基于上述细胞内双重酶促反应实现了一步定向固定化β₂AR蛋白的SPR传感芯片的高效制备，扫描电镜、表面元素分析和接触角分析等方法对固定化β₂AR的SPR芯片进行表征，并将其成功应用于受体-药物相互作用研究（图2和图3），与现有的基于氨基偶联的随意固定化方法和以脱卤素酶等大标签为例的酶标签-自催化固定化方法相比，由于无需纯化蛋白且LPETG标签分子量小，具有固定化受体涂层密度大、稳定性和重复性好的特点，显著提高了受体-药物亲和力测定的准确度和灵敏度。

图2  固定化β₂AR传感芯片的制备及表征

固定化β₂ARSPR传感芯片制备路线图（a）；SEM形貌分析（b）；能谱元素分析（c）；接触角分析（d）。

图3 配体与固定β₂AR的相互作用研究

班布特罗在裸芯片（a1）和固定化β₂AR传感芯片（a2）上的SPR传感信号图及亲和力测定拟合图（a3）；妥布特罗在裸芯片（b1）和固定化β₂AR传感芯片（b2）上的SPR传感信号图及亲和力测定拟合图（b3）；沙丁胺醇在裸芯片（c1）和固定化β₂AR传感芯片（c2）上的SPR传感信号图及亲和力测定拟合图（c3）； 特布他林在裸芯片（d1）和固定化β₂AR传感芯片（d2）上的SPR传感信号图及亲和力测定拟合图（d3）

作者团队

西北大学生命科学学院师资博士后赵雪为论文第一作者。西北大学生命科学学院李倩副教授和陕西理工大学梁引库教授为共同通讯作者。本研究得到了国家自然科学基金面上项目(22374116；22074118)、陕西省自然科学基础研究项目（2024JC-TBZC-21）、陕西省重点研发计划项目（2024SF-ZDCYL-02-132）、国家资助博士后研究人员计划项目（GZC20241385）和陕西省博士后科研项目（2023BSHEDZZ229）的资助。